botoks cennik wrocław

Próbki potraktowane H2O2 ponownie zawieszono w ml PPHB zawierającego wskazane stężenie H2O2 przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyto 4 razy PPHB (1 ml po każdym przemyciu). Następnie dodano SOD1 (250 pmoli) w 10. L PPHB do każdej probówki z perełkami i próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut z okresowym łagodnym mieszaniem. Kulki następnie przemyto 3 razy PPHB w celu usunięcia niezwiązanego SOD1. Czwarte płukanie przeprowadzono w 50 mM Tris (pH 6,8). Białka eluowano przy użyciu 20 .l 125 mM imidazolu, a próbki następnie mieszano z redukującym obciążenie buforem SDS-PAGE i rozdzielano przez SDS-PAGE dla Western blotting. Test Rac1 GTPazy Testy Rac1 GTPazy przeprowadzono jak opisano wcześniej (46), z modyfikacjami. Znakowane His Rac1 lub Cdc42 (25 pmol) inkubowano z 25 pmol GTP i 2,5 pmola P32-znakowanego a-GTP w buforze wiążącym GTP zawierającym 50 mM HEPES (pH 7,6), 150 mM NaCl i 0,1 mM EDTA przez 10 minut w temperaturę pokojową, a następnie umieszczono na lodowatej wodzie. Następnie pobierano porcję 1-. L do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) jako czas 0 tej reakcji GTPazy. Do każdej reakcji dodano trzy białka w różnych kombinacjach. w tym bydlęca SOD1, E. coli SOD1, i / lub p29-GAP. jak wskazano w Wynikach i legendach figur. Stosunek molowy Rac1 lub Cdc42 do p29-GAP wynosił 1: 1. Stosunek molowy Rac1 lub Cdc42 do SOD1 wynosił 1:10. Aby rozpocząć reakcję GTPazy, do każdej warunku w 15 ° C dodano równą objętość 2 x buforu GTPase zawierającego 50 mM HEPES (pH 7,6), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA i 10 mM MgCl2. Tam, gdzie to wskazano, 100 mU oksydazy ksantynowej inkubowano w mieszaninie reakcyjnej z końcowym stężeniem ksantyny wynoszącym 100. M. Porcje (1. L) wykryto na płytce TLC z każdej próbki w różnych punktach czasowych. TLC prowadzono przez 90 minut w temperaturze pokojowej w 1M kwasie octowym z 0,8M LiCl buforem roboczym. W celu ilościowej oceny hydrolizy GTP, wolne pasma fosforanu (Pi) wycinano wraz z odpowiednimi pasmami GTP. Każdą z nich umieszczono w ciekłym płynie scyntylacyjnym i zliczono za pomocą ciekłej spektrometrii scyntylacyjnej. Procent hydrolizowanego GTP obliczono jako Pi podzielony przez sumę Pi i GTP. Konstruowanie białek fuzyjnych GST-Rac1 i GST-SOD1 Bakteryjne konstrukty ekspresyjne dla WT i mutantów delecyjnych GST-Rac1 i / lub GST-SOD1 wytworzono za pomocą klonowania za pośrednictwem PCR, do wektora pGex-2T (Amersham Biosciences). Wszystkie bakteryjne konstrukty fuzyjne zostały potwierdzone przez pełne sekwencjonowanie. Mutacje ALS L8Q (47) i G10V (48) wprowadzono do GST-SOD1 przy użyciu systemu do mutagenezy ukierunkowanej genetycznie in vitro (Promega). Sekwencja starterów użyta do wytworzenia mutanta L8Q to 5a-AAGGCCGTGTGCGTGCAGAAGGGCGACGGCCCA-3 .. Sekwencja starterów użyta do wytworzenia mutanta G10V była 5a-AAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGTTGACGGCCCA-3 .. Ekspresja i oczyszczanie bakteryjnych białek znakowanych GST Znakowane GST konstrukty ekspresyjne transformowano do E. coli przy użyciu selekcji ampicyliną. Kolonie bakterii niosące WT i zmutowane konstrukty hodowano w pożywce LB zawierającej 100 .g / ml ampicyliny w 1-litrowych kolbach w 37 ° C do gęstości komórek A600 = 0,6. Następnie dodano izopropylo-D-tiogalaktopiranozyd do mM w celu indukcji ekspresji białek znakowanych GST, a hodowle hodowano przez 6 godzin w 37 ° C. Bakterie zebrano przez 4 000 g spinu przez 15 minut w 4 ° C i ponownie zawieszono w PBS na lodzie. Następnie bakterie poddano lizie na lodzie za pomocą 5-sekundowych impulsów ultradźwiękowych przy użyciu wirionowego środka rozrywającego komórki (VirTis Gardiner). Następnie lizat bakteryjny odwirowano przy 30 000 g przez 30 minut w celu usunięcia grudek. Białka fuzyjne oczyszczono z ekstraktów komórkowych przy użyciu kulek glutationowo-sefarozowych (Amersham Biosciences) zgodnie z instrukcjami producenta, a białka fuzyjne GST wymyto 10 mM glutationu, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 120 mM. NaCl
[więcej w: badanie trus, pieprzyca siewna, jolanta krajewska allegro ]