cena badania hcv

Dwusekwencyjne sekwencjonowanie amplifikowanych produktów nie wykazało mutacji w ORF GRK3 lub w GRK2, -5 i -6. Spekulowaliśmy, że obniżony poziom transkryptów GRK3 w komórkach P3 może wynikać z 2 mechanizmów nie wykluczających się wzajemnie: nieskutecznej syntezy mRNA lub zwiększonej degradacji mRNA. Przebieg czasowy stabilności mRNA GRK3 przeprowadzono w obecności inhibitora transkrypcji aktynomycyny D (ActD) w fibroblastach z P3, P4 i 2 zdrowych osobników. Szacuje się, że okres półtrwania (> 3 godz.) Stabilnego genu mRNA, dehydrogenazy mleczanowej (LDH), jest podobny we wszystkich typach komórek (rysunek 7A). Stwierdzono, że mRNA GRK3 mają krótki okres półtrwania (~ h), a ich stabilność była w tym samym zakresie zarówno w fibroblastach kontrolnych jak i pochodzących od pacjenta (Figura 7B). Te odkrycia wykluczają możliwość, że upośledzona stabilność mRNA odpowiada za zmniejszenie transkryptów GRK3 w fibroblastach P3, i spierają się o zmienioną transkrypcję GRK3. W ten sposób ustaliliśmy eksperymenty Act / pulse dla ActD i ustalono, że 4-godzinne leczenie ActD było wystarczające do zubożenia mRNA GRK3 (<15% poziomów przed leczeniem) we wszystkich typach komórek (Figura 7C). Po 4 godzinach po podaniu ActD, poziom mRNA GRK3 w pełni odzyskano w P4 i kontrolnych fibroblastach, podczas gdy osiągnął on tylko 50% wstępnych poziomów w fibroblastach P3. Podsumowując, wyniki te silnie sugerują, że obniżony poziom białek GRK3 w komórkach P3 wynika przede wszystkim z zaburzonej syntezy mRNA GRK3 i ostatecznie prowadzi do defektywnego tłumienia CXCR4. Figura 7 Ekspresja i stabilność mRNA GRK3 w fibroblastach WHIMWT. Fibroblasty z P3, P4 i zdrowych osobników inkubowano z 10 .g / ml ActD (leczenie) we wskazanych czasach (A i B) lub przez 4 godziny i dalej hoduje się przez 4 godziny pod nieobecność ActD (chase) (C ). We wskazanych czasach całkowite RNA ekstrahowano i przeprowadzono półilościowe PCR stosując specyficzne startery flankujące pełną ORF LDH lub GRK3. Amplifikowane produkty cDNA były prowadzone na 1% żelu agarozowym, wykrywane przez barwienie bromkiem etydyny i oznaczane ilościowo za pomocą densytometrii wspomaganej komputerowo przy użyciu oprogramowania ImageJ 1.34 (NIH). Wyniki pochodzą z reprezentatywnego eksperymentu na 3 (A i B) lub są środkami. SD z 3 niezależnych oznaczeń (C) i wskazują ilość mRNA, które pozostały po inkubacji z ActD (A i B) lub które nagromadziły się w trakcie działania ActD (C). Poziomy transkryptów w fibroblastach inkubowanych w samej pożywce ustalono jako 100%. Kinetyka wyglądu mRNA LDH była porównywalna we wszystkich typach komórek (dane nie pokazane). * P <0,05. GRK3 negatywnie reguluje migrację komórkową promowaną przez CXCL12. Postawiliśmy hipotezę, że wzmocniona chemotaksja promotorowa CXCL12 komórek P3, wcześniej proponowana do polegania na ogniotrwałości CXCR4, aby była odczulona i internalizowana (6), może być znormalizowana po ekspresji GRK3. Aby rozwiązać ten problem, leukocyty od zdrowych i P3 osobników transfekowano albo wektorem kontrolnym albo plazmidem kodującym cDNA GRK3 (dodatkowa figura 2D). Potwierdzając nasze poprzednie ustalenia, limfocyty T CD4 + z P3 wykazywały silniejszą odpowiedź chemotaktyczną w kierunku gradientu CXCL12 w stosunku do kontroli (Figura 8A). Stwierdziliśmy, że ekspresja GRK3 znacząco zmniejsza propagowaną przez CXCL12 migrację kontrolnych komórek T (hamowanie 30%. 40% w porównaniu do komórek transfekowanych wektorem), co sugeruje, że GRK3 odgrywa ujemną rolę w regulacji tego procesu. Zgodnie z tym, ekspresja GRK3 w leukocytach z P3 umożliwiła przywrócenie prawidłowych odpowiedzi chemotaktycznych indukowanych przez CXCL12. Figura 8 Konsekwencje ekspresji lub odrzucania GRK3 na chemotaksję promowaną przez CXCL12. (A) Leukocyty ze zdrowych osób (CTRL nr 1) i P3 poddano nukleoporacji za pomocą 5 .g pcDNA1 (wektor) lub plazmidu kodującego cDNA GRK3 i badano 15 godzin po transfekcji pod kątem chemotaksji w odpowiedzi na CXCL12. [przypisy: ashwagandha skutki uboczne, bazofile niski poziom, bliznowiec po operacji ]