chirurg naczyniowy w rzeszowie

Aby wykazać fenestrae w LSECs, przeprowadzono SEM. Immunomagnetycznie sortowane LSEC utrzymywano przez noc na szklanych szkiełkach nakrywkowych pokrytych kolagenem. Hodowane komórki utrwalono w 1% tetratlenku osmu, 0,1 M kakodylanie sodu, 0,2 M sacharozie, 5 mM MgCl2, pH 7,4, (bufor SEM) przez 5 sekund, a następnie 2 zmiany 2,5% aldehydu glutarowego w buforze SEM. Komórki zostały utrwalone w 1% tetratlenku osmu w buforze SEM, odwodnione przez stopniowy etanol, punkt krytyczny wysuszony przy użyciu ciekłego dwutlenku węgla w Tousimis Samdri 795 Critical Point Dryer i pokryty przez napylanie złotym palladem w Denton Vacuum Desk-2 Sputter Coater. Komórki badano za pomocą mikroskopu JEOL JSM6400 (JEOL USA Inc.) pod napięciem przyspieszającym 10 kV. Analiza tkanki. W badaniach immunofluorescencji próbki wątroby utrwalono w 4% paraformaldehydzie w PBS, pH 7,4, (PBSA PAF), zrównoważono w 30% sacharozie, zatopiono w optymalnej żywicy o temperaturze chłodzenia i zamrożono w 2-metylobutanie w. 80 ° C. Kriostatyczne przekroje o grubości od 5 do 6 urn zablokowano w buforze zawierającym 5% surowicę kozią, 1% BSA i 0,1% Triton X-100 w PBS i inkubowano z króliczą przeciwciałem anty-GFP (1: 300; Molecular Probes) i ze szczurzym przeciw-mysim F4 / 80 (1: 500; Serotec) lub szczurzym przeciwciałem przeciwko mysiemu CD31 (1: 100; BD Biosciences. Pharmingen). W celu barwienia vWF, skrawki tkanki barwiono króliczym przeciwciałem przeciw vWF (1: 100, Sigma-Aldrich). W celu wybarwienia Ki67, skrawki tkanki utrwalono w 1% PAF, utrwalono kwasem etanol-octowym (2: 1) i wybarwiono króliczym przeciwciałem anty-Ki67 (1: 1000, Vector Laboratories Inc.). Skrawki inkubowano z Alexa Fluor 488. lub skoniugowana z Alexa Fluor 546P kozie anty-królicze IgG i Alexa Fluor 488. lub Alexa Fluor 546 (3 sprzężone kozie anty-szczurze IgG z użyciem DAPI-Antifade do barwienia jądrowego (Molecular Probes). W celu wykazania wychwytu lipoproteiny w przeszczepionych LSEC in vivo, 50. L DiI-Ac-LDL (Biomedical Technologies) wstrzyknięto dożylnie przez żyłę ogonową myszom (23). Po 2 godzinach zwierzęta poddano eutanazji; próbki wątroby zostały utrwalone, jak opisano powyżej. Przygotowano 6- (3-gękie krioskrawki wątroby, a następnie barwienie kontrastowe jąder z DAPI. Skrawki tkanki badano w epifluorescencji, a obrazy pozyskiwano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Observer.Z1 (Carl Zeiss Microimaging Inc.). W niektórych przypadkach wykonano mikroskopię na tych samych sekcjach tkanki za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica AOBS do skanowania laserowego i uzyskano obrazy obrotowe i obrazy sekcji z. Analiza apoptozy. Test TUNEL przeprowadzono przy użyciu komercyjnego zestawu (Apoptag; Serologicals Corp.) zgodnie z opisem producenta. Izolowane LSEC były albo cytospunami na szkiełkach, albo hodowano jak opisano powyżej przez 24 godziny. Zamrożone tkanki użyto do uzyskania kriosekcji utrwalonych za pomocą PAF i utrwalonych kwasem etanolowym (2: 1). Jądra były wybarwione kontrastowo DAPI-Antifade (Molecular Probes). TEM. Aby ustalić ultrastrukturalną integralność przeszczepionych komórek, wykonano TEM. Usunięto wątrobę z przeszczepionych biorców komórek i nietraktowanych myszy kontrolnych, a plasterki grubości do 2 mm osadzano w lodowatym 4% paraformaldehydzie w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,4, przez 3 godziny z ciągłym wytrząsaniem, po czym plastry przepłukano zimnym buforem fosforanowym. Skrawki tkanki o grubości w przybliżeniu 15 .m zostały wykonane za pomocą Lancer Vibratome (Polysciences) i eksponowane sekwencyjnie na pierwotnej króliczej anty-GFP (1: 200; Molecular Probes) i wtórnej osiołowej IgG przeciwko peroksydazie chrzanowej IgG (1: 1000; ImmunoResearch), a następnie inkubuje się z tetrahydratem 3,3 -diaminobenzydyny (DAB) (Sigma-Aldrich) przy pH 7,0. Te odcinki tkanki zostały utrwalone w 1% tetraokslenku osmu i osadzone w eponie (Polysciences)
[przypisy: pieprzyca siewna, bliznowiec po operacji, artefakty ruchowe ]