dentus felczaka szczecin

Odkrycia te sugerują zwiększenie funkcji mutantów SOD1, co prowadzi do nasilonej aktywacji Nox i uszkodzenia komórek. Apocynin, znany inhibitor oksydaz NADPH, taki jak Nox2 (9), znosi zmutowany S02, OAT1 zależny od NADPH produkcja tylko w komórkach glejowych, z odpowiednim wzrostem żywotności komórek (rysunek 1E). Natomiast apocynina nie hamowała zależnego od NADPH O2. wytwarzanie w komórkach neuronowych SH-SY indukowanych przez zmutowaną ekspresję SOD1, ani nie chroniło przed związanym z nią uszkodzeniem komórek (Figura 1E). Te wyniki sugerują, że rozregulowane wytwarzanie ROS w komórkach neuronowych wykazujących ekspresję mutanta SOD1 zachodzi prawdopodobnie w szlaku innym niż w komórkach glejowych. Uważa się, że apocynina hamuje oksydazy NADPH przez zakłócanie rekrutacji p47phox do kompleksu Nox (10). Wykazano, że trzy znane podjednostki katalityczne Nox są regulowane przez p47phox in vitro (Nox1, Nox2 i Nox3) (7, 11) i te izoformy Nox są również regulowane przez małą GTPase Rac (8). Jednakże, jak dotąd tylko potwierdzono, że Nox2 jest regulowany przez p47phox in vivo. W tym celu postawiliśmy hipotezę, że zmutowana ekspresja SOD1 w komórkach glejowych MO59J reagujących na apocyninę wzmaga aktywację Rac1. Rzeczywiście, zarówno zmutowane białka SOD1G93A, jak i SOD1L8Q podniosły poziomy Rac1-GTP w komórkach MO59J w porównaniu z nadekspresją SOD1WT, jak określono za pomocą testów pulilowania Pak1 (Figura 1F). Co ważniejsze, rdzenie kręgowe z myszy transgenicznych ALS nadeksprymujących mutanta SOD1G93A wykazywały jeszcze większe wzmocnienie poziomów Rac1-GTP (tj. Aktywowany Rac1) w porównaniu z nietransgenicznymi dopasowanymi wiekiem kontrolami (Figura 1F). Te odkrycia o zwiększonej aktywacji Rac1 przez ekspresję mutanta SOD1 doprowadziły nas do postawienia hipotezy, że SOD1 bezpośrednio oddziałuje z Rac1 i / lub innymi złożonymi składnikami Nox, aby ustabilizować aktywowaną postać tego kompleksu. Na poparcie tej hipotezy są wcześniejsze ustalenia, że zarówno SOD1, jak i Rac1 rekrutują się do wczesnych endosomów aktywnych wobec Nox2 po stymulacji cytokiną (12). Rac1 wiąże się z SOD1 w sposób zależny od redoks. Aby zbadać potencjalnych partnerów wiążących SOD1, które były związane z kompleksem Nox, przeprowadziliśmy eksperymenty IP dla p47phox, p67phox, p22phox i Rac1. 4 regulatory kompleksu Nox2. z lizatów tkanki mózgowej, a następnie Western blotting dla SOD1 i stwierdzono, że tylko Rac1 skutecznie pociągnął SOD1 (Figura 2A i dane nie przedstawione). Aby określić, czy interakcje Rac1 / SOD1 występują w innych typach tkanek, przeprowadziliśmy eksperymenty na co-IP z kilku narządów mysich, w tym mózgu, wątroby, nerki i serca. Rzeczywiście, IP Rac1 odciągał SOD1 z każdego z tych narządów u myszy SOD1 + / +, ale nie SOD1. /. myszy (Figura 2A). Ilość SOD1 związanego z Rac1 była zauważalnie najwyższa w mózgu i najniższa w sercu. Aby sprawdzić, czy ta interakcja była bezpośrednia, zastosowaliśmy testy pulsowania in vitro z oczyszczonymi białkami. Unieruchomiony His-tagowany Rac1 wyraźnie związany z SOD1, gdy Rac1 był wstępnie obciążony GDP. S, ale nie wtedy, gdy Rac1 był wstępnie obciążony GTPyS lub w nieobecności nukleotydu (Figura 2B). W przeciwieństwie do tego związana GTPaza Rho Cdc42 nie wiązała się z SOD1 (Figura 2B). Wyniki te sugerują, że związana z GDP forma Rac1 wiąże się z SOD1. Figura 2Rac1 wiąże się z SOD1 w sposób zależny od redoks. (A) Rac1 IP z serca, nerek, wątroby i / lub tkanki mózgowej SOD1 + / + lub SOD1. /. myszy, a następnie Western blotting (WB) dla SOD1 i Rac1. (B) IP in vitro oczyszczonych znakowanych His Rac1 i Cdc42 w obecności oczyszczonego bydlęcego SOD1, a następnie Western blot dla SOD1, Rac1 i Cdc42. Znakowane His GTPazy wstępnie obciążono wskazanymi analogami nukleotydów przed inkubacją z SOD1. (C) IP in vitro oczyszczonego His-tagowanego Rac1 w obecności oczyszczonego natywnego, demetalowanego lub remetalowanego bydlęcego SOD1, a następnie Western blot dla SOD1 i Rac1
[podobne: artefakty ruchowe, badanie trus, allegro pontony ]