dermatolog ostrzeszów nfz

Czystość białka oceniano za pomocą SDS-PAGE barwionego Coomassie, a stężenia białka znormalizowano stosując metodę Bradforda. Należy zauważyć, że białka fuzyjne GST-Rac1 zawierające 88 lub 116 aminokwasów z N-końca Rac1 migrują konsekwentnie szybciej niż ich przewidywane masy cząsteczkowe w SDS-PAGE, co było prawdopodobnie spowodowane zmienionymi właściwościami fałdowania domen zawartych w tych mutantach delecyjnych. . Białka SOD1 znakowane GST odszczepiono z GST stosując zestaw do wychwytywania trombiny (EMD Bioscences). Po rozszczepieniu białka SOD1 oddzielono od przeciętego znacznika GST przy użyciu kolumny FPC z glutationem i sefarozą. Demetalizacja SOD1 Demetalację oczyszczonego bydlęcego SOD1 przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (1), z modyfikacją. Cu i Zn usunięto przez eksponowanie oczyszczonego bydlęcego SOD1 na PBS (pH 3,0) plus 2 mM EDTA i mieszanie przez 60 minut w 4 ° C. Białko następnie dializowano przez noc wobec 50 mM fosforanu potasu (pH 7,4). Następnie frakcję zdetalowanego bydlęcego SOD1 powtórnie zesłano przez dializę wobec 100 mM octanu sodu (pH 5,5) w obecności 40-krotnego nadmiaru molowego Zn, a następnie 4-krotny molowy nadmiar Cu. Aby usunąć niezwiązane metale, białko SOD poddano następnie kilkukrotnej dializie wobec PBS (pH 7,4). Zawartość Cu / Zn natywnego, demetalowanego i remetalowanego bydlęcego SOD1 określono w sposób opisany uprzednio (49). W skrócie, 10 .g SOD1 zmieszano z ml buforu testowego zawierającego 100 mM boranu sodu (pH 7,8), 2% SDS i 100 .M pirydylozororcynolu (PAR). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez 20 minut w 100 ° C. Poziomy Zn i Cu obliczono jako spadek w odczytach 500 nm mierzony na spektrofotometrze Shimadzu UV-160 po dodaniu 0,8 mM kwasu nitrylotrioctowego (NTA) i EDTA, odpowiednio. Zawartość Zn lub Cu w SOD1 podano jako stosunek molowy Zn lub Cu do SOD1. Żele aktywności enzymu SOD1 przeprowadzono w sposób opisany powyżej (43). W skrócie, 10 ng natywnego, demetalowanego lub remetalowanego SOD1 przeprowadzono na natywnym 12% żelu poliakryloamidowym. Aktywność SOD1 określono przy użyciu redukcji nitroblue tetrazolium. Aktywność enzymatyczną zdefiniowano jako strefy usuwania w tle czarnego osadu. Frakcjonowanie podkomórkowe Izolacja wszystkich endomembran. Komórki lub tkanka poddano lizie w buforze do homogenizacji (50 mM Tris-HCl, 320 mM sacharoza i mM EDTA, pH 7,4) przez kawitację azotem. Lizat (600 .g) odwirowano następnie przy 3000 g, aby wytworzyć potrójny supernatant pozbawiony ciężkich mitochondriów (PNS), a następnie supernatant odwirowano przy 100 000 g przez godzinę, aby zlać całkowite endomembrany. Membrany przepłukano 3 razy w buforze homogenizacyjnym przed ponownym zawieszeniem w 150 .l buforu do homogenizacji przed testami aktywności Nox. Rozdzielanie jodiksanolu endosomów. Wirowanie w gęstości pływającej zastosowano do frakcjonowania subkomórkowego i izolacji endosomów zawierających aktywność Nox2, Rac1 i SOD1. Komórki przemyto dwukrotnie lodowato zimnym PBS i zdrapano do 1,5 ml probówki do mikrowirówki przy użyciu tego samego buforu. Komórki osadzono i ponownie zawieszono w buforze do homogenizacji (HMB) zawierającym 0,25 M sacharozy, 20 mM HEPES (pH 7,4), mM EDTA i koktajlu inhibitora proteazy wolnego od EDTA. Komórki homogenizowano stosując kawitację azotem w komorze wysokociśnieniowej z rozbijaniem komórek (przyrządy Parr). Ciśnienie podniesiono do 650 psi przez 5 minut i nagle uwolniono. Homogenat odwirowano przy 3000 g przez 15 minut, aby uzyskać grudki nieuszkodzone, jądra i ciężkie mitochondria. Ciężki supernatant mitochondrialny (HMS) załadowano na dnie do nieciągłego gradientu jodiksanolu w 12,5 ml probówce ultrawirówkowej SW41Ti przy użyciu poprzednio opisanej metody z modyfikacjami (50, 51). Nieciągły gradient składał się z 1,25 ml HMB bez EDTA, a następnie z dolnym obciążeniem następujących kolejnych etapów jodiksanolu: 1,0 ml 2,5%, 1,0 ml 5%, 1,5 ml 9%, 1,5 ml 14%, 2,5 ml 19%, 1,5 ml 26 %, a na koniec HMS w 2 ml 32%. Stężenia jodiksanolu przygotowano na świeżo, stosując 50% roztwór roboczy jodiksanolu (WS) rozcieńczony HMB bez EDTA. WS przygotowano przez dodanie części buforu zawierającego 0,25 M sacharozy i 120 mM HEPES (pH 7,4) do 5 części jodiksanolu 60% roztworu podstawowego. Gradienty wirowano przy 100 000 g, stosując wirujący wirnik SW41Ti przez noc w 4 ° C. Frakcje zebrano od góry probówki za pomocą kolektora frakcji (Labconco) w 500-. L frakcjach na lodzie. Endo
[przypisy: artefakty ruchowe, bartoneloza, bliznowiec po operacji ]