fedorowicz zamość gabinet prywatny

Cienkie pionowe linie na żelu wskazują, że ścieżki były prowadzone na tym samym żelu, ale nie były spójne. Przedstawiono reprezentatywny eksperyment z 2 niezależnych oznaczeń 2 (C) lub> 5 (A i B). Różne receptory chemokinowe eksprymowano ektopowo w kontrolnych i fibroblastach WHIMWT i komórkach B w celu porównania ich funkcjonalności w odpowiedzi na ich pokrewny ligand. Tylko komórki WHIMWT eksprymujące CXCR4 wykazywały silniejsze reakcje migracyjne i na wszystkie stężenia ligandów, co wskazuje na wyższą skuteczność CXCL12 w stosunku do tych komórek (Figura 2A). Stosując aktywowaną CXCL12 polimeryzację aktynową jako wskaźnik zależnej od CXCR4 aktywacji białka G, stwierdziliśmy, że zwiększona chemotaksja komórek WHIMWT była związana z opornością CXCR4 na odczulenie w odpowiedzi na CXCL12 (Figura 2B). W komórkach WHIMWT, CXCR4 był również oporny na indukowaną CXCL12 internalizację, ale pozostał wrażliwy na traktowanie induktorem PMA forbolu PKC (Figura 2C). Ryc. 2Selektywna zmiana funkcjonowania CXCR4 w komórkach WHIMWT. (A) Komórki EBV-B od osobników CTRL i P4 nukleopowano 5 .g plazmidów kodujących cDNA CCR5, CCR7, CXCR2, CXCR4 lub CXCR5 i badano 15 godzin po transfekcji pod kątem chemotaksji przy użyciu systemu Transwell w odpowiedzi na pokrewną chemokinę. (lewa sekcja). Oparta na stężeniach migracja komórek B eksprymujących CXCR4 jest pokazana w odpowiedzi na CXCL12 (prawy odcinek). Wyniki wyrażono jako procent wejściowych komórek B, które migrowały do dolnej komory. (B) Fibroblasty eksprymujące CXCR4 (lewy panel) i komórki B eksprymujące CXCR4 (środkowy panel) lub CXCR5 (prawy panel) testowano pod kątem aktywowanej przez CXCL12 lub CXCL13 polimeryzacji aktyny przy użyciu FITC-falloidyny jako sondy do wewnątrzkomórkowej F-aktyny. Strzałki wskazują na stymulację chemokiną. Poziom podstawowy niestymulowanych komórek został ustawiony jako 100% (linia kropkowana). (C) Ekspresja na powierzchni komórek różnych receptorów chemokin w kontrolnych (CTRL # 1) i fibroblastach WHIMWT traktowanych 200 nM pokrewnego agonisty przez 45 minut w 37 ° C. Wyniki wskazują na ilość receptorów, które pozostają na powierzchni komórki po inkubacji z agonistą. Ekspresję receptora na powierzchni komórek inkubowanych w samej pożywce ustalono jako 100%. Po transfekcji poziomy ekspresji różnych receptorów chemokin były porównywalne na powierzchni wszystkich niestymulowanych typów komórek, co określono za pomocą cytometrii przepływowej (dane nie przedstawione). Wyniki reprezentują środki. SD z 3. 5 niezależnych doświadczeń (A i C) lub reprezentatywnych dla 3 niezależnych oznaczeń (B). * P <0,05; ** P <0,005 w porównaniu do osób zdrowych. Odkrycia te pokazują, że fibroblasty WHIMWT i komórki EBV-B wykazują dysfunkcje CXCR4 zgłaszane w powiązanych leukocytach pierwotnych pacjenta (6) i że inne receptory chemokin, w tym CXCR7, są w pełni wrażliwe na ich pokrewny ligand. Analizy genetyczne wskazują na brak mutacji w ORF CXCR4, CXCR7 i CXCL12 w limfocytach (leukocytach i komórkach EBV-B) i / lub komórkach nieflastycznych (fibroblasty skóry) pochodzących z P3 i P4, wykluczając w ten sposób możliwość wystąpienia nieprawidłowego CXCL12 - zależne odpowiedzi wynikają z anomalii ukierunkowanych na jeden z tych genów. W związku z tym postawiliśmy hipotezę, że upośledzona odczulanie i internalizacja CXCR4 w komórkach WHIMWT polega na nieprawidłowym produkcie genu, który bezpośrednio lub pośrednio wpływa na zależną od agonisty fosforylację i / lub sprzężenie CXCR4 ze szlakiem endocytowym. internalizacja CXCR4 za pośrednictwem. -arrestiny jest zachowywana w komórkach WHIMWT. Komórkowe poziomy a-arestyny2 określają stopień desensytyzacji CXCR4 i internalizacji (8. 10). [hasła pokrewne: alfa pvp skutki uboczne, urobilinogen w moczu norma, bazofile poniżej normy ]