jar medic jarocin lekarze

Rozszerzone leukocyty IL-2 (3, które zawierały> 95% CD25 + piaskowanych komórek T, jak oceniono za pomocą cytometrii przepływowej, od niezależnych zdrowych osobników nukleoporowano 5 | j siRNA SCR lub GRK3. Dwa dni po transfekcji, leukocyty testowano pod kątem ich zdolności do migracji w odpowiedzi na CXCL12 (prawy panel). Transmigowane komórki odzyskane w dolnej komorze wybarwiono mAb specyficznymi dla antygenów CD3 i CD4 i zliczono za pomocą cytometrii przepływowej. Wyniki wyrażone jako procent wejściowych limfocytów T ze wstawionymi komórkami CD4 +, które migrowały do dolnej komory, są reprezentatywne dla tych uzyskanych w limfocytach T znakowanych CD8 +. Poziomy transkryptu GRK3 oceniano za pomocą ilościowej PCR i znormalizowano do poziomów IDUA (B, lewy panel). Zahamowanie lub zwiększenie ekspresji GRK3 nie miało wpływu na ekspresję CXCR4 na powierzchni komórki. Wyniki pochodzą z reprezentatywnego oznaczenia 2 przeprowadzonego w trzech egzemplarzach (A) lub są środkami. SD z 3 niezależnych oznaczeń wykonanych w dwóch powtórzeniach (B, prawy panel) lub w trzech powtórzeniach (B, lewy panel). * P <0,05; ** P <0,005 w porównaniu z leukocytami transfekowanymi siRNA wektorowym lub SCR. Przez znoszenie mRNA GRK3 w leukocytach od zdrowych osobników, dalej badano zależność migracji komórkowej za pośrednictwem CXCR4 od aktywności GRK3. Jak określono metodą PCR w czasie rzeczywistym, dupleks GRK3 siRNA skutecznie obniżył poziomy transkryptów GRK3 o ponad 60% (Figura 8B). Dodanie CXCL12 dało zależną od dawki chemotaksję komórek T CD4 + transfekowanych siRNA SCR (Figura 8B). Wspierając negatywną rolę dla GRK3 w chemotaksji promowanej CXCL12, stwierdziliśmy, że czułość limfocytów T CD4 + wyciszonych w GRK3 do CXCL12 była silnie zwiększona. Proces ten wiązał się ze zmniejszeniem maksymalnego skutecznego stężenia CXCL12. Dyskusja Badanie molekularnych przyczyn dysfunkcji CXCR4 u 2 pacjentów cierpiących na genetyczną formę zespołu WHIM niezwiązaną z mutacją CXCR4 ujawnia zaskakującą zależność funkcjonowania CXCR4 od aktywności GRK3. Na przykład nasze dane pokazują kluczową rolę dla GRK3 w desensytyzacji promowanej przez CXCL12 i internalizacji CXCR4. Wskazują również na zmiany w aktywności GRK3 w komórkach pochodzących od pacjentów, które prawdopodobnie odpowiadają za dysfunkcje CXCR4. Kilka obserwacji potwierdza tę możliwość. Po pierwsze, komórki kontrolne znokautowane dla mRNA GRK3 wykazywały osłabienie atenuacji CXCR4 i polepszoną chemotaksję w odpowiedzi na CXCL12, podobnie jak komórki WHIMWT. Po drugie, ekspresja GRK3 w komórkach WHIMWT przywróciła zdolność CXCR4 do odczulenia i internalizacji w odpowiedzi na CXCL12. Wreszcie, a może przede wszystkim, odkryliśmy w komórkach pochodzących od jednego pacjenta selektywny spadek produktów GRK3, który prawdopodobnie powstaje w wyniku zaburzonej syntezy mRNA i której korekta doprowadziła do znormalizowanej chemotaksji. Sugerowana przez CXCL12 desensytyzacja i internalizacja CXCR4 są uważane za zależne od wiązania (3-parkiny do receptora fosforylowanego przez GRK (8, 9, 18). Nasze dane kwestionują możliwość, że. -Arrestin1 lub. -Arrestin2 per se może być zaburzony w komórkach pochodzących od pacjenta i raczej wskazuje aktywność GRK3 jako etap ograniczający. W komórkach WHIMWT i kontrolnych ustalono, że poziom a-betazyny w stanie stacjonarnym jest podobny (Figura 3, A i B i Suplementowa Figura 1C), jak również internalizacja receptorów chemokin innych niż CXCR4 (Figura 2C) . Wyniki te sugerują, że szlak endocytowy za rekrutacją a-aretyny do receptorów jest zachowany w komórkach WHIMWT. Zgodnie z tym, ekspre-sowane ektopowo a-premiony, a zwłaszcza a--reston2, miały zdolność modulowania internalizacji CXCR4 (Figura 3). [hasła pokrewne: babka płesznik dawkowanie, bliznowiec po operacji, bartoneloza ]