laboratorium wrocławska jastrzębie

Wyniki te reprodukowano w endosomach izolowanych z pierwotnych mysich zarodkowych fibroblastów (PMEF) WT, w których wytwarzano zależny od NADPH O2. został wywołany przez dodanie bydlęcego SOD1, ale nie przez SOD E. coli (Figura 3H), pomimo jednakowej zdolności obu enzymów do rozszczepienia O2. (Dodatkowa figura 3). Nasze wyniki pokazujące, że SOD1 może regulować aktywację Rac1 / Nox2 w sposób zależny od redoks, dostarczyły wglądu w funkcję SOD1. Jednak nadal nie było jasne, w jaki sposób mutacje związane z ALS w SOD1 rozregulowały aktywację Rac1 i aktywność Nox. W tym celu wygenerowaliśmy i oczyściliśmy ludzkie WT1 SOD1 i 2 ludzkie zmutowane białka ALS SOD1 (L8Q i G10V) z bakterii jako fuzje GST i przecinaliśmy GST przed analizą (Figura 3I). Warto zauważyć, że generowanie fuzji SOD1G93A GST nie powiodło się, prawdopodobnie z powodu toksyczności tej fuzji u bakterii. Jednakże, w przeciwieństwie do poprzednich badań, w których wykazano, że SOD1G93A ma normalną aktywność enzymatyczną (31), białka SOD1L8Q i SOD1G10V oczyszczone z E. coli nie wykazywały aktywności wobec dysazytu w porównaniu z SOD1WT przygotowanym w tych samych warunkach (Figura 3I). Co interesujące, oba ludzkie zmutowane białka SOD1L8Q i SOD1G10V miały zwiększoną zdolność wiązania Rac1 w porównaniu z ludzkim SOD1WT (Figura 3J). W przeciwieństwie do ludzkiego SOD1WT, wiązanie tych mutantów SOD1 z Rac1 nie zostało przerwane przez ROS pochodzący z X / XO (Figura 3J), co sugeruje, że regulacja redoks oddziaływań SOD1 / Rac1 jest zmieniona przez mutacje L8Q i G10V w SOD1. Co ważne, ludzkie zmutowane białka SOD1L8Q i SOD1G10V również wykazywały zwiększoną zdolność do hamowania hydrolizy Rac1-GTP w porównaniu z ludzką SOD1WT (Figura 3K). Zredukowana metalizacja ludzkiego SOD1WT pochodzącego z bakterii doprowadziła do zmniejszenia skuteczności hamowania aktywności Rac1-GTPazy w porównaniu z oczyszczonym bydlęcym SOD1 (Figura 3I), co było prawdopodobnie wynikiem zmniejszonego powinowactwa wiązania z Rac1 pokazanego na Figurze 2C. Jednakże wydaje się, że zakres metalacji ma mniejszy wpływ na zdolność ludzkich białek SOD1 pochodzących z bakterii do wiązania Rac1 i hamowania aktywności GTP-azy. W oparciu o powyższe wyniki postawiliśmy hipotezę, że niektóre mutacje ALS w SOD1 mogą rozregulować aktywację Nox2 w przedziale endosomalnym z racji ich bardziej trwałej i niewrażliwej na reakcję redoks aktywacji Rac1. W tym celu przetestowaliśmy przebieg czasowy O2 zależnego od NADPH. wytwarzanie przez wyizolowane frakcje endosomalne po dodaniu ludzkich białek SOD1WT lub SOD1L8Q. Jak wcześniej zaobserwowano dla bydlęcej SOD1WT (Figura 3H), ludzki SOD1WT aktywował wytwarzanie O2 zależnego od NADPH. przez wyizolowane endosomy PMEF (Figura 3L). Ta aktywacja w O2. produkcja osiągnęła maksimum 15 minut i powróciła do wartości wyjściowych o godzinę. Taka przejściowa aktywacja była zgodna z ROS pochodzącym od Nox hamującym oddziaływania SOD1 / Rac1 i aktywującym hydrolizę GTP przez Rac1, prowadząc do samoregulacji redukcji aktywacji Nox. Natomiast dodanie SOD1L8Q do endosomów PMEF dało początek trwałemu O2 zależnemu od NADPH. produkcja, do godziny (rys. 3L). Łącznie wyniki te sugerują, że mutant SOD1L8Q ALS jest rozregulowany pod względem zdolności do aktywacji Nox2 dzięki zmienionym interakcjom wrażliwym na redoks z Rac1. Takie wyniki są zgodne z podwyższoną aktywnością Nox w rdzeniach kręgowych i mózgach myszy ALS. Leczenie inhibitorem Nox-apocyniny zwiększa długość życia i spowalnia progresję choroby u myszy ALS. Nasze odkrycie, że niektóre mutacje SOD1 związane z ALS prowadzą do pierwotnych defektów w aktywacji Nox sugeruje, że hamowanie aktywacji Nox może być terapeutycznie korzystne w ALS. Rzeczywiście, 2 ostatnie badania wykazały, że delecja Nox2 może zwiększać przeżycie i opóźniać początek choroby u myszy ALS (3, 5)
[podobne: allegro pontony, bol pod lewa lopatka, ból pod lewą łopatką przyczyny ]