lekarze nefrolodzy wrocław

Ilościowe analizy PCR i IB ujawniły, że dupleks siRNA skutecznie i specyficznie zubożał ekspresję każdego docelowego GRK o więcej niż 75% w porównaniu z siRNA wymieszanej kontroli (SCR) (Figura 4C). Jak pokazano na fig. 4D, wyciszanie mRNA GRK3 prowadziło do wyraźnego hamowania internalizacji CXCR4 po ekspozycji na CXCL12, podczas gdy tłumienie ekspresji GRK2 nie miało wpływu na ten proces. Podsumowując, nasze wyniki wskazują na niedocenianą wcześniej specjalizację GRK3 w regulacji internalizacji CXCR4. Następnie ustaliliśmy, czy poprzez regulację internalizacji CXCR4, GRK3 przyczynia się również do odczulania receptorów. W fibroblastach WHIMWT tylko ekspresja GRK3 była w stanie przywrócić normalną zależną od CXCR4 aktywację białka G po stymulacji CXCL12 (Figura 4E). Łącznie, wyniki te ujawniają kluczową rolę GRK3 w regulacji odczulania i internalizacji CXCR4 oraz wskazują na GRK3 jako kandydata odpowiedzialnego za upośledzone osłabienie CXCR4 w komórkach WHIMWT. Wspierając to założenie, komórki kontrolne wyciszone przez GRK3 wykazały upośledzoną endocytozę CXCR4 po ekspozycji na CXCL12, podobnie jak komórki WHIMWT. Odwrotnie, ekspresja GRK3 w komórkach WHIMWT normalizowała odczulanie CXCR4 i endocytozę. Te obserwacje przemawiają za ilościową lub jakościową zmianą w GRK3 w komórkach WHIMWT. Różnicowe stacjonarne poziomy produktów GRK3 w białaczkach WHIMWT. Aby zbadać, czy komórki WHIMWT wykazują ilościową zmianę w białkach GRK3, ocenialiśmy przez IB poziomy GRK2, -3, -5 i -6 w lizatach całych komórek z pierwotnych leukocytów izolowanych z P3, P4 i zdrowych osobników, w tym członków rodziny P4 (Figura 5A). Nie wykryto zmian poziomów GRK3 w leukocytach z P4 (Figura 5A). Przeciwnie, poziomy GRK3 w leukocytach z P3 były znacznie zmniejszone w porównaniu z kontrolami, podczas gdy poziomy GRK2, -5 i -6 w stanie stacjonarnym były prawidłowe, co wykryto dla Abs, które reagują specyficznie z GRK2 lub -6 lub GRK5. / 6 pary (Figura 5B i dodatkowa Figura 2, A i C). Spadek poziomów białka GRK3, również potwierdzony w fibroblastach P3 (Figura 6A), uzyskano stosując mAb, który reaguje z białkami GRK2 i -3 (> 60% redukcji w porównaniu z komórkami kontrolnymi) (dodatkowa Figura 2, C i D) oba łatwo odróżniają się od dubletu (Suplementowa Figura 2B) lub Ab, które selektywnie rozpoznają białka GRK3 (~ 90% redukcji w porównaniu z kontrolami) (dodatkowa Figura 2, A i D). Figura 5 Zredukowane poziomy produktów GRK3 w leukocytach P3. (A i B) Poziomy stacjonarne białek GRK w leukocytach z P4 (A) i P3 (B) porównano z tymi uzyskanymi w leukocytach z członków rodziny i osobnika zdrowego (CTRL nr 1), odpowiednio. Całkowite ekstrakty białkowe (20 .g / ścieżkę) analizowano przez IB przy użyciu przeciwciał anty-GRK2 / 3, -GRK2, -GRK3, -GRK5 / 6 lub -GRK6. (C i D) Stężenia transkryptów GRK w leukocytach z P3 (C) i P4 (D) w stanie stacjonarnym porównywano metodą PCR z uzyskanymi w leukocytach od członków rodziny i osób zdrowych (CTRL # 2. 5). Półilościowe (C, środkowy panel i D) i PCR w czasie rzeczywistym (C, prawy panel) przeprowadzono stosując specyficzne startery flankujące, odpowiednio, pełne ORF GRK lub w nich. Jedno pasmo odpowiadające zamplifikowanemu LDH (~ 1,3 kb), GRK2 (~ 2,2 kb), GRK3 (~ 2,1 kb), GRK5 (~ 1,8 kb) lub GRK6 (~ 1,8 kb) produktom cDNA wykryto w każdej próbce za pomocą półproduktu. ilościowy PCR. Cienkie, poziome linie w żelu wskazują, że ścieżki były prowadzone na tym samym żelu, ale nie były jednoznaczne. Wyniki pochodzą z reprezentatywnego eksperymentu 3 (A. D) lub są środkami. SD z 3 niezależnych oznaczeń wykonanych potrójnie (C, prawy panel)
[podobne: wodniak powrózka nasiennego, ból pod lewą łopatką przyczyny, bazofile niski poziom ]