opole lekarz sportowy

Różne poziomy stacjonarne produktów GRK3 w fibroblastach WHIMWT. Analizy poziomu białka i mRNA GRK w fibroblastach z P3, P4 i 2 niezależnych zdrowych osobników (CTRL nr i nr 2) zostały przeprowadzone przez IB (A), półilościowe (B) i PCR w czasie rzeczywistym (C) jak opisano w legendzie z rysunku 5. Wyniki pochodzą z reprezentatywnego eksperymentu 6 (A i B) lub są środkami. SD z 3 niezależnych oznaczeń wykonanych trzykrotnie (C). ** P <0,005 w porównaniu z CTRL # 1. Aby określić, czy spadek białek GRK3 zidentyfikowanych w leukocytach P3 został odbity lustrzanie na poziomie mRNA, całkowity RNA wyizolowano z P3 i leukocytów kontrolnych, a poziomy transkryptów GRK3 w stanie stacjonarnym oceniano za pomocą analizy PCR. Używając półilościowego PCR, stwierdziliśmy, że prążek odpowiadający zamplifikowanemu produktowi cDNA GRK3 był ledwo wykrywalny w leukocytach P3 w porównaniu z komórkami kontrolnymi, co sugeruje drastyczne zmniejszenie ilości transkryptu GRK3 w komórkach P3 (Figura 5C). Przeciwnie, poziomy mRNA GRK2, -5 i -6 w stanie stacjonarnym były podobne w leukocytach P3 i kontrolnych. Ilości transkryptów GRK w leukocytach P4 nie różniły się od tych wykrywanych w komórkach kontrolnych, co pokazano za pomocą półilościowej analizy PCR (Figura 5D). Następnie opracowaliśmy analizę PCR w czasie rzeczywistym w celu ilościowego oznaczenia poziomów mRNA GRK3 w leukocytach P3 w porównaniu z tymi wykrytymi u 5 niezależnych zdrowych osobników, spośród których 3 to członkowie rodziny (Figura 5C). Stałe poziomy transkryptów GRK3 u osobników kontrolnych były wyświetlane w dużym zakresie (Figura 5C). Obserwacja ta jest prawdopodobnie konsekwencją zmienności międzyosobniczej, która jest również objawiona przez podobną analizę porównawczą przeprowadzoną w leukocytach z P4 i zdrowych członków rodziny P4. (Suplementowa Figura 3). Jednak poziomy mRNA GRK3 były poza zakresem w leukocytach P3 (Figura 5C) i tylko nieznaczne ilości były wykrywalne zgodnie z półilościową analizą PCR. Potwierdziliśmy również przez PCR w czasie rzeczywistym, że poziomy w stanie stacjonarnym innych mRNA GRK były ilościowo nieobjęte komórkami P3 (dane nie przedstawione). Tak więc wyniki te wskazują, że wyraźna zmiana poziomów białka GRK3 w leukocytach P3 koreluje z selektywnym spadkiem na poziomie mRNA. Ponadto, nasze odkrycia silnie sugerują, że obniżony poziom białek GRK3 w stanie stacjonarnym w leukocytach P3 wynika ze zmiany mechanizmu (post) transkrypcyjnego, a nie ze stabilności białka. Defektywna ekspresja mRNA GRK3 w fibroblastach P3. Badania nad stabilnością RNA przeprowadzono w fibroblastach pochodzących od pacjentów, które stanowią bardziej homogenny system komórkowy niż leukocyty. Jak pokazano na Figurze 6A, fibroblasty z P3 wykazywały selektywną redukcję (> 75%) w poziomach białka GRK3 w stosunku do kontroli, podobnie jak leukocyty (patrz Figura 5B). Potwierdziliśmy również, że na poziomach stacjonarnych białek GRK2, -3, -5 i -6 nie stwierdzono wpływu na fibroblasty i komórki EBV-B (dane nie pokazane) z P4. Warto zauważyć, że ekspresja egzogennie GRK3, która okazała się przywracać internalizację CXCR4 i desensytyzację w fibroblastach P3 i P4 (Figura 4, A, B i E), osiągnęła podobne poziomy wśród fibroblastów kontrolnych i pacjentów, które w dużej mierze przekraczały endogenne (Suplemental 2C). Podczas gdy ilości mRNA GRK pozostawały niezmienione w fibroblastach P4 w porównaniu z kontrolnymi, obserwowaliśmy drastyczny spadek (> 85%) transkryptów GRK3 w fibroblastach P3 (Figura 6, B i C). Pojedynczy produkt cDNA GRK3 zamplifikowano za pomocą PCR, stosując specyficzne startery flankujące pełną ORF w leukocytach pochodzących od pacjenta (Figura 5) i fibroblastach (Figura 6).
[patrz też: neurologopedia lublin, bliznowiec po operacji, ból pod lewą łopatką przyczyny ]