ortodonta ceramiczna 7 warszawa

Wiązanie SOD1 z tym regionem w Rac1 jest również zgodne z obserwowanymi różnicami w wiązaniu pomiędzy SOD1 i GTPyS- w porównaniu z Rac1 wychwytu SF skierowanego względem S-S. Co ciekawe, Rac1 guanina-czynnik wymiany nukleotydów (GEF) Tiam1 wiąże się z regionem Rac1, który obejmuje interakcję domeny z SOD1 (19). Ponadto regiony przełączające na 2 pokrewnych GTPazach Rho, RhoA i Cdc42, są zaangażowane w wiązanie z RhoGAP (20, 21). Dlatego postawiliśmy hipotezę, że SOD1 wpływa na aktywność Rac1, działając jako GEF lub GAP. Jednak SOD1 nie wpływał znacząco na ładowanie GTP na Rac1 in vitro (Supplemental Figure 2D) iw związku z tym wydawał się nie działać jako GEF. SOD1 reguluje aktywację Rac1 / Nox2, a ta funkcja jest rozregulowana w niektórych mutantach SOD1 ALS. Następnie ocenialiśmy, czy SOD1 służy jako GAP do stymulacji hydrolizy GTP przez Rac1. Taka hipoteza była zgodna z podwyższonymi poziomami Rac1-GTP w zmutowanych komórkach glejowych wyrażających SOD1 (3 i rdzeniu kręgowym (Figura 1F). Jednak SOD1 znacząco hamował aktywność GTP-azy Rac1, a także uniemożliwiał p29Rho-GAP aktywację hydrolizy GTP przez Rac1 (Figura 3A). Jednakże, SOD E. coli, homolog ssacza MnSOD / SOD2, nie zmienia aktywności GTPazy Rac1 (Figura 3B), ani nie kojarzy się z Rac1 in vitro (dane nie pokazane). Zdolność SOD1 do hamowania hydrolizy GTP była również specyficzna dla Rac1 i nie obserwowano go z blisko spokrewnioną małą GTPazą Cdc42 (Figura 3C). Ponadto, demetalowany (tj. Enzymatycznie nieaktywny) SOD1, który nie wiązał się z Rac1 (Figura 2C), również nie hamował aktywności GTPazy Rac1 (dodatkowa Figura 2E). Biorąc pod uwagę, że Rac1 ma wyjątkowo wysoką wewnętrzną aktywność GTP-azy (22), odkrycia te są zgodne z SOD1 działającym w celu stabilizacji Rac1-GTP poprzez hamowanie jego aktywności GTP-azy. Figura 3SOD1 aktywuje Rac1 i Nox2, funkcję rozregulowaną w pewnych mutantach SOD1 ALS. (A i B) Testy GTPazy Rac1 przeprowadzono w obecności lub nieobecności oczyszczonego (A) bydlęcego SOD1 lub (B) E. coli MnSOD i / lub p29-GAP. Znakowany His Rac1 był wstępnie obciążony P32-GTP, a porcje reakcji analizowano w różnych punktach czasowych metodą TLC dla hydrolizy GTP, oceniając procent uwalniania 32Pi z Rac1. (C) Test GTPazy dla Rac1 i Cdc42 w obecności lub nieobecności bydlęcego SOD1 i / lub p29-GAP. (D) Test GTPazy Rac1 w obecności lub nieobecności bydlęcego SOD1 i / lub X / XO (100 mU, końcowe stężenie 100. M). (E) Testy Pulldown z GTP-S załadowanego His-tagowanego Rac1 w obecności bydlęcego SOD1 z lub bez 15-minutowej ekspozycji na ROS pochodzący z X / XO. Dane są reprezentatywne dla co najmniej 3 niezależnych eksperymentów. (F) Endosomy izolowano z PMDF stosując frakcjonowanie gradientem gęstości jodiksanolu, a frakcje charakteryzowano metodą Western blot dla Nox2gp91phox, Rac1, SOD1 i EEA1. (G) Testy Lucigenin zastosowano do oceny szybkości O2 zależnej od NADPH. wytwarzanie we frakcjach 10 pęcherzyków z Nox2 WT i KO PMDF w obecności lub nieobecności 2,5. M bydlęcego SOD1 i / lub 10. M DPI, ogólnego inhibitora Nox (n = 6). (H) Frakcje pęcherzykowe z PMEF heterozygotycznych pod względem rozerwania genu mysiego SOD1 oceniono pod kątem O2 zależnego od NADPH. wytwarzanie w obecności lub nieobecności egzogenicznie dodanych 2,5. M bydlęcego SOD1 lub 2,5. M E. coli MnSOD (n = 3). (I) SDS-PAGE barwione błękitem Coomassie oczyszczonych bakteryjnych białek SOD1. Bydlęca SOD1 zastosowano jako kontrolę odniesienia i migruje szybciej niż ludzki SOD1 (12). Pokazano zawartość Cu / Zn w każdym białku SOD1. Żel działania SOD białek SOD1 oczyszczonych przez bakterie przedstawiono na dole. (J) IP in vitro oczyszczonego prereduced His-tagowanego Rac1-GTPyS w obecności wskazanych ludzkich białek SOD1. Kompleksy Rac1 / SOD1 zostały następnie podzielone na 2 części; połowę traktowano ROS pochodzącym z X / XO przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed OD znacznika His
[więcej w: bazofile niski poziom, bliznowiec po operacji, jolanta krajewska allegro ]