otolaryngologiczne

Ultracienkie 50-nanometrowe skrawki przygotowano z ultramikrotom LKB, wybarwiono cytrynianem ołowiu i badano pod mikroskopem elektronowym Philips 300 (FEI Co.) (47). Analiza cytometrii przepływowej. W celu oceny stopnia reopulacji wątroby komórkami GFP-dodatnimi wykonaliśmy analizę cytometrii przepływowej. Komórki wątroby wyizolowano od myszy poddanych przeszczepowi komórek przez trawienie wątroby przez kolagenazę, a hepatocyty usunięto poniżej 50 g, jak opisano powyżej. Z całkowitej nie-miąższowej frakcji komórek wątroby 2 x 106 komórek inkubowano z 3 (III anty-mysim CD16 / CD32 (1 .g / 106 komórek, receptor Fcy III / II, BD Biosciences. Pharmingen) na lodzie. Po 15 minutach dodano znakowany allofikocyjaninem anty-mysi CD31 lub NK.1 (1 ul / 106 komórek, BD Biosciences . Pharmingen) i komórki trzymano przez 30 minut na lodzie i / lub sprzężonym z PE anty-mysim CD11b. CD45 (1 ul / 106 komórek, BD Biosciences Pharmingen), endoglin (5 ul / 106 komórek, R & D), Tie2 lub Flk-1 (2 ug / 106 komórek, eBioscience). Komórki przemyto i ponownie zawieszono w 4% FBS / PBS. Aby zidentyfikować nieżywotne komórki dodano .g / ml jodku propidyny (Sigma-Aldrich). Cytometrię przepływową przeprowadzono przy użyciu FACSCalibur z x 106 zdarzeń na próbkę. Dane analizowano za pomocą oprogramowania CellQuest (BD Biosciences. Pharmingen) lub oprogramowania Flowjo FACS (Tree Star Inc.). Testy RT-PCR. Całkowity RNA ekstrahowano za pomocą odczynnika Trizol (Invitrogen) i traktowano DNazą (DNaza wolna od RNazy, QIAGEN). cDNA przygotowano z 2 do 4 .g całkowitego RNA przy użyciu zestawu Omniscript RT (QIAGEN). W przypadku FVIII, FIX i vWF, równe ilości cDNA poddano PCR za pomocą polimerazy DNA Hot StartTaq (QIAGEN), stosując 95 ° C do początkowej denaturacji, a następnie 35 cykli denaturacji w 94 ° C przez 30 sekund, hybrydyzacji w 50 ° C przez 45 sekund (dla FVIII) lub 60 ° C przez 45 sekund (dla FIX) i 62 ° C przez 45 sekund (vWF), wydłużanie w 72 ° C przez minutę i końcowe wydłużanie w 72 ° C przez 7 minut. Startery FVIII to 5a-CCCTATTATAAGAGCAGAAGTTGA-3. (do przodu) i 5. -CCAATTAATCCCGAGTGCATATC-3. (wsteczny), jak opisano wcześniej (48). Startery FIX zawierały 5-CTCAGTTGTTGGTGGAGAAAACG-3. (forward) i 5. -TTTTCCCCAGCCACTGACATAGCCA-3. (wsteczny), jak opisano (2). primery vWF były 5a-TGTTCATCAAATGGTGGGCAGC-3. (forward) i 5. -ACAGACGCCATCTCCAGATTCA-3. (wsteczny), jak opisano (49). W przypadku innych genów cDNA amplifikowano za pomocą Platinum PCR Supermix (Invitrogen) w następujący sposób: 30 cykli w 94 ° C przez 3 minuty, 94 ° C przez 30 sekund, 55 ° C lub 57 ° C przez minutę, 72 ° C przez minutę. minutę i końcowe wydłużenie w 72 ° C przez 7 minut. Startery były następujące: VEGF: 5a-TCTTCAAGCCGTCCTGTGTG-3. (forward) i 5. -AGGAACATTTACACGTCTGC-3. (rewers); VEGFR2: 5. -CGAGTCTGTCTACCTTGGAGGC-3. (forward) i 5. -CAGCCTGAGCCTTTACCGC-3. (50); MMP-9: 5. -TTGAGTCCGGCAGACAATCC-3. (forward) i 5. -CCTTATCCACGCGAATGACG-3. (wsteczny) (51); CXCR4: 5. -AGCCTGTGGATGGTGGTGTTTC-3. (forward) i 5. -CCTTGCTTGATGACTCCCAAAAG-3. (wsteczny) (52); SDF-1.: 5. -CCAAGGTCGTCGCCGTGCTG-3. (do przodu) i 5-CTCCAGTTACTCTTGGATCCAC-3. (wsteczny) (53). Startery SDF-1 zaprojektowano stosując sekwencję GenBank NM_001012477. Startery myszy P-aktyny były 5 (3-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3. (forward) i 5. -CTTCCTTATTGTCACGCACGATTTC-3. (wstecz) (52). Produkty PCR rozdzielono w 1,5% żelu agarozowym. Oczekiwane wielkości produktów były następujące: FVIII, 276 pz; vWF, 270 bp; VEGF-A, 331 do 350 pz; VEGFR2, 350 pz; MMP-9, 433 bp; CXCR4, 200 pz; SDF-1, 245 pz; i P-aktyna, 540 pz. Analiza PCR. Genomowy DNA ekstrahowano za pomocą zestawu DNeasy Tissue Kit (QIAGEN). Startery dla GFP zawarte w LSECs myszy FVB / N-Tie2a GFP były oIMR1263 5. – ATTCTCGTGGAACTGGATGG-3. i oIMR1264 5. -GGACAGGTAATGGTTGTCTGG-3. (Jackson Laboratory; http://jaxmice.jax.org/strain/003658_2) Zastosowano Platinum PCR Supermix (Invitrogen) z 30 cyklami w 94 ° C przez 3 minuty, 94 ° C przez 30 sekund, 60 ° C przez minutę, 72 ° C przez minutę i ostatecznym wydłużeniem w 72 ° C przez 7 minut (Jackson Laboratory, http://jaxmice.jax.org/strain/003658_2). Startery dla myszy GAPDH były 5 (3-GGGTGGAGCCAAACGGGTC-3. (forward) i 5. -GGAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3. (wsteczny), z 25 cyklami w 94 ° C przez 3 minuty, 94 ° C przez 30 sekund, 56 ° C przez minutę, 72 ° C przez minutę i 72 ° C przez 7 minut, jak
[patrz też: bioimpedancja elektryczna, ashwagandha skutki uboczne, jolanta krajewska allegro ]