podgrzybek złotawy zdjęcia

Znakowany His Rac1 był wstępnie załadowany wskazanymi analogami nukleotydów przed inkubacją z SOD1. Dodatkowo, nietraktowane znakowane His His Rac1 i 300 . M DTT wstępnie zredukowane His-oznaczone Rac1 zostały użyte do testów in vitro pulldown z każdą z 3 form SOD1. (D) znakowany His Rac1 był wstępnie redukowany (300 .M DTT), obciążony GTPyS i traktowany wskazanymi stężeniami H2O2 przed przeprowadzeniem testów z użyciem SOD1. (E) Wskazane stężenia DTT dodano do 300 pM traktowanej H2O2 próbki His znakowanego His w D, a testy z użyciem pulldown przeprowadzono z SOD1. (F) Schemat mutantów delecyjnych GST-Rac1 stosowanych do zdefiniowania domeny wiążącej SOD1 i IP in vitro różnych mutantów delecyjnych Rac1 znakowanych GST w obecności oczyszczonego bydlęcego SOD1. Powyższe numery konstruktów fuzji GST-Rac1 odpowiadają numerom linii poniżej. Górne pasy to Western blot dla SOD1 po IP GST; dolne ścieżki są barwionymi Coomassie żelami oczyszczonych peptydów fuzyjnych stosowanych w IP. Biorąc pod uwagę, że Rac1 może regulować O2. produkcja poprzez pewne oksydazy NADPH (13, 14) i że SOD1 dysyduje O2. do H2O2 postawiliśmy hipotezę, że aktywność enzymatyczna SOD1 ma fundamentalne znaczenie dla interakcji z Rac1. Wiązanie Cu w miejscu aktywnym SOD1 jest niezbędne dla jego aktywności enzymatycznej, a specyficzna chaperon Cu jest wymagany do obciążenia SOD1 Cu w warunkach in vivo (15). Korzystając z testów in vitro, zapytaliśmy, czy interakcja między Rac1 i SOD1 była regulowana redoks i czy zawartość metalu w SOD1 wpłynęła na tę interakcję. Co ciekawe, redukcja Rac1 za pomocą DTT zmieniła preferencję nukleotydową wymaganą do wiązania z SOD1 (Figura 2C). Niesredukowana bakterio wyrażona Rac1 najskuteczniej wiąże się z SOD1 w obecności GDP. S, jak pokazano na Figurze 2B. Przeciwnie, zredukowano Rac1 przywiązany do SOD1, gdy był załadowany GTP. S, ale nie GDP. S (Figura 2C). Ponadto, tylko metalowane (tj. Natywne) i ponownie wyekstrahowane formy SOD1 związane z Rac1, podczas gdy demetalowane (tj. Enzymatycznie nieaktywne) SOD1 nie były zdolne do wiązania Rac1 (Figura 2C i dodatkowa Figura 2A). Przeciwnie, ani zredukowane Cdc42-GTPyS ani Cdc42-GDPSS nie wiązały SOD1 (dodatkowa Figura 2B). Odkrycia te pokazują, że SOD1 może rzeczywiście wiązać Rac1-GTP w warunkach redukujących i sugerować, że stan redox Rac1 wpływa na jego powinowactwo do SOD1 w GTP w stosunku do stanów związanych z GDP. Zaintrygowani tymi wynikami, staraliśmy się bezpośrednio przetestować, czy sekwencyjna redukcja i utlenianie cyklów Rac1 związanych z GTP Rac1 do stanów związanych SOD1 i niezwiązanych, odpowiednio. W tym celu wyeksponowaliśmy Rac1 (zredukowany za pomocą DTT i wstępnie obciążony GTP. S) do różnych stężeń H2O2 i oceniliśmy jego zdolność do wiązania z SOD1 po usunięciu nadmiaru H2O2 i stwierdziliśmy, że stężenia H2O2 tak niskie jak 50 pM spowodowały znaczące zmniejszenie powinowactwo wiązania Rac1 do SOD1 (rysunek 2D). Aby wykluczyć możliwość nieodwracalnego uszkodzenia białka Rac1 za pomocą H2O2, powtórzyliśmy ten sam eksperyment dodając różne stężenia DTT do utlenionego Rac1 eksponowanego na 300 pM H2O2. Istotnie hamowanie wiązania Rac1 / SOD1 za pośrednictwem H2O2 zostało odwrócone przez traktowanie Rac1 50. 300. M DTT (Figura 2E). Te dane asocjacyjne in vitro pokazują, że wiązanie Rac1 / SOD1 jest regulowane redoks i może przechodzić między stanami związanymi i niezwiązanymi w zależności od stanu redox Rac1. Aby określić domenę Rac1 związaną z SOD1, skonstruowaliśmy mutanty delecyjne znakowane GST Rac1 (Figura 2F) i przeprowadziliśmy testy pulldown in vitro. SOD1 najbardziej skutecznie wiąże region Rac1 zawarty w aminokwasach 35-70 (Figura 2F). Ten region Rac1 obejmuje kilka domen ważnych dla wiązania nukleotydów (tj. Domeny przełącznika I, G2, przełącznika II i G3, Suplementowa Figura 2C;
[więcej w: logopedia lublin, wodniak powrózka nasiennego, bazofile poniżej normy ]