rzeczniów mapa google

Komórki zebrano w 36, 48 i 72 godzinie po zakażeniu, odpowiednio, w testach aktywacji Rac, testach aktywności Nox i testach śmierci komórkowej. Rekombinowane adenowirusy eksprymujące SOD1WT lub LacZ zostały wcześniej opisane (43). Mutacje L8Q i G93A w SOD1 wprowadzono do wektora prowirusowego pAd.CMVlinkwtSODl, stosując system do mutagenezy ukierunkowanej genetycznie in vitro (Promega). Wirusy zostały następnie wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem (44). Test wykluczania błękitem trypanu Komórki trypsynizowano i ponownie zawieszono przez delikatne pipetowanie 72 godziny po infekcji adenowirusowej. 0,4% roztwór błękitu trypanowego (50 ul) dodano do 200 | jl zawiesiny komórek dla końcowego stężenia błękitu trypanowego 0,08%. Zawiesinę komórek inkubowano następnie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a liczbę zabarwionych komórek zliczano za pomocą hemocytometru. Procent martwych komórek obliczono jako liczbę wybarwionych komórek podzieloną przez całkowitą liczbę komórek. Barwienie DHE in situ dla O2. Myszy poddano eutanazji z przedawkowaniem pentobarbitalu sodu. Lędźwiowy rdzeń kręgowy został natychmiast usunięty i osadzony w OTC jako odcinki o długości 4 mm. Z każdej grupy 30-milimetrowe sekcje były natychmiast generowane w ciągu kilku godzin po osadzeniu i zabarwione w DHE w następujący sposób. Skrawki przepłukano PBS zawierającym 100 | jM rotenonu w celu zahamowania oddychania mitochondrialnego przed inkubacją z 1. M DHE (Invitrogen) przez 5 minut w ciemności i ciągłą obecnością 100. M rotenonu. Skrawki następnie przepłukano PBS i przykryto szkiełkami mocującymi Vectashield zawierającymi DAPI. Fluorescencję DHE wykryto stosując filtr emisji rodaminy. Ustawienia ekspozycji dla mikroskopu / kamery były utrzymywane na stałym poziomie między próbkami w ramach pojedynczego eksperymentu, a zwierzęta kontrolne i eksperymentalne były zawsze przetwarzane równolegle. IP i blotting Western myszy SOD1 (Sod1tm1Leb) zakupiono od Jackson Laboratories (45). Lizaty tkankowe z miotów z WT i SOD1 KO wytworzono przez homogenizację w lodowatym PBS, a następnie dodano równą objętość 2 x buforu do lizy zawierającego 40 mM Tris-HCl (pH 7,4), 300 mM NaCl, 2% Triton X- 100, 100 mM NaF, 80 mM P-glicerofosforanu, 10 mM EDTA i tabletkę koktajlową inhibitora proteazy. Stężenie białka zmierzono za pomocą testu Bradforda. IP białek Rac1 przeprowadzono przez inkubację 600 .g całkowitego białka z 4 .g pierwotnego przeciwciała anty-Rac1 (Upstate Cell Signaling Solutions) w 500 .l buforu do lizy, a następnie obracano przez 2 godziny w 4 ° C. Następnie dodano kulki proteinowe A, przemyte dwukrotnie buforem do lizy i obracano je przez noc w 4 ° C, a następnie magnetycznie usuwano kompleksy IP. Kulki przemyto 4 razy buforem do lizy. Peletki ponownie zawieszono w buforze obciążającym redukującym SDS-PAGE i inkubowano w temperaturze 98 ° C przez 5 minut przed rozdzieleniem za pomocą SDS-PAGE. Membrany nitrocelulozowe niosące przeniesione białka były blokowane przez noc w 4 ° C w buforze blokującym zawierającym 4% w / v beztłuszczowego mleka w proszku i 0,3% Tween 20 w PBS i inkubowane z pierwszorzędowymi przeciwciałami do SOD1 (The Binding Site Limited) i Rac1 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), a następnie ze skoniugowanymi z barwnikiem podczerwonym przeciwciałami drugorzędowymi. Prążki białek wykryto w systemie obrazowania w podczerwieni Odyssey (LI-COR Biotechnology). Testy Pulldown ze znakowanymi His białkami Szpon Dynabeads dla znakowanych His białek przemyto buforem fosforanowym (PPHB) zawierającym 100 mM KH2PO4, 10 mM NaCl, 0,25 mM MgCl2 i 100 nM CaCl2. Znakowane His Rac1 lub Cdc42 (25 pmol) inkubowano ze 100 ul perełek w PPHB w temperaturze pokojowej przez 30 minut z nieciągłym delikatnym mieszaniem. GTPazy stosowano bezpośrednio lub wstępnie załadowano mM GTPyS lub GDPaS w buforze wiążącym GTP (50 mM HEPES (pH 7,6), 150 mM NaCl i 0,1 mM EDTA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodano stężenia końcowego MgCl2 do 10 mM i przemyć PPHB
[podobne: alfa pvp skutki uboczne, wodniak powrózka nasiennego, urobilinogen w moczu norma ]