skąpe miesiączki po 40

Przed operacją transplantacji komórek u myszy z hemofilią A NOD / SCID, podawano 4 U białka FVVIII przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej (Refacto, Wyeth Research). W celu oceny korekcji fenotypu hemofilii stosowano test prowokacji ogonem, jak opisano wcześniej (45). Myszy znieczulono 5% izofluranem i utrzymywano podczas znieczulenia 1,5% izofluranem. Żyłę wrotną odsłonięto przez laparotomię, a 2 x 106 LSEC wstrzyknięto w 0,3 ml DMEM bez surowicy (GIBCO; Invitrogen) przy użyciu igieł 27-gauge. Hemostazę zabezpieczono przez krótką presję na 5 minut w miejscu wstrzyknięcia. Niektóre zwierzęta otrzymywały 53 mg / kg FLP (Deepwater Chemicals Inc.) w roztworze soli dootrzewnowo tuż przed przeszczepieniem komórek. Inne zwierzęta otrzymywały 200 mg / kg MCT (Sigma-Aldrich) w roztworze soli dootrzewnowo w ciągu 24. 72 godzin przed przeszczepem komórek śródotrzewnowych lub 2. 4 tygodnie przed izolacją komórek w celu przeanalizowania wpływu MCT na dawcy LSECs. W celu uzyskania tępych odpowiedzi immunologicznych przeciwko reporterowi transgenu GFP, myszom FVB / N podano 30 . 50 mg / kg cyklofosfamidu (CYTOXAN, Bristol-Myers Squibb) w normalnym roztworze soli fizjologicznej ip dwa razy w tygodniu przez czas trwania badania, poczynając od dnia operacji ( 46). Izolacja i charakterystyka komórek. Wątroba była perfundowana przy 5 ml / min przez żyłę wrotną przez 15 minut z buforem w 37 ° C zawierającym 1,9 mg / ml EGTA, przez 2 minuty z buforem bez EGTA, i przez 7. 9 minut z buforem zawierającym 0,03% (w / v ) kolagenaza i 5 mM CaCl2.2H2O. Bufor do perfuzji zawierał 10 mmol / HEPES, 3 mmol / l KCl, 130 mmol / l NaCl, mmol / l NaH2P04.H2O i 10 mmol / l d-glukozy, pH 7,4 (Sigma-Aldrich, kolagenaza z Worthington Biochemical Corp.). Wątroby zdysocjowano w buforze perfuzyjnym i komórki przepuszczono przez tkaninę Dacron z 80-. M porów i odwirowano dwukrotnie pod 50 g przez 5 minut w celu usunięcia hepatocytów. NPC w supernatancie przemyto i granulowano pod 350 g przez 10 minut i frakcjonowano za pomocą Percoll (Sigma-Aldrich) w początkowych doświadczeniach, jak opisano (8). Dodatkowo, po lizy czerwonych krwinek w 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM EDTA przez 6 minut na lodzie, LSEC wybrano z frakcji NPC przez sortowanie immunomagnetyczne (Miltenyi Biotec Inc.). W tym celu komórki 2 x 107 ponownie zawieszono w 200 .l buforu do rozdzielania (PBS, pH 7,2, 2 mM EDTA, 0,5% BSA, Sigma-Aldrich) wraz z 10 .l / × 107 komórek sprzężonych z anty-CD45a kulki (Miltenyi Biotec) przez 20 minut w 4 ° C. Komórki peletowano pod 350 g przez 8 minut w 4 ° C, ponownie zawieszono w 500. L buforu rozdzielającego i zastosowano do MS Separation Columns (Miltenyi Biotec), a komórki CD45-ujemne zebrano dla rundy selekcji pozytywnej stosując anty-LSEC. skoniugowane cząstki magnetyczne (Miltenyi Biotec) przez 30 minut w 4 ° C. Wyizolowane LSEC ponownie zawieszono w DMEM bez surowicy i peletowano pod 350 g przez 8 minut w 4 ° C przed przeszczepieniem. Żywotność komórek określono przy użyciu wykluczenia barwnika błękitem trypanowym. Skuteczność rozdziału komórek zweryfikowano przez wybarwienie komórek za pomocą znakowanego allofikocyjaninem anty-mysiego CD31 (1 ul / 106 komórek, BD Biosciences . Pharmingen), a następnie analizę za pomocą cytometru przepływowego FACSCalibur wyposażonego w oprogramowanie CellQuest (BD Biosciences). Test żywotności komórek przy użyciu niebieskiego barwnika tiazolilowego. Wyselekcjonowane immunomagnetycznie LSEC wysiano na 4 x 105 / cm2 i hodowano przez noc w szalkach powleczonych kolagenem z pożywką 199 (Sigma-Aldrich) zawierającą 20% FBS, 100 (jg / ml EC-czynnik wzrostu (Sigma-Aldrich) i antybiotykami (GIBCO ; Invitrogen). Po dniu dodano barwnik błękit tiazolilowy (MTT) do końcowego stężenia mg / ml przez 2 godziny w 37 ° C. Komórki solubilizowano w DMSO, a produkt reakcji mierzono przy 580 nm z odejmowaniem tła przy 675 nm. SEM
[patrz też: artefakty ruchowe, badanie trus, bazofile niski poziom ]